IV형 인플루엔자 바이러스에 대한 닭배아 수확액의 하류 정제 공정에 대한 최적화 연구(1부)

인플루엔자(독감이라고도 함)는 다양한 호흡기 질환을 일으킬 수 있는 전염성이 높은 호흡기 감염 질환입니다. 세계보건기구(WHO)의 권위 있는 데이터에 따르면 매년 약 10억 명의 사람들이 인플루엔자 바이러스로 인해 위협을 받고 있습니다. 인플루엔자 바이러스(IV)는 Orthomyxoviridae 계열에 속하며 단일-음성-센스 RNA 바이러스입니다. 인플루엔자 바이러스 입자는 구형이고 직경이 80~120nm이며 구조는 외부에서 외피, 매트릭스 단백질, 코어의 3개 층으로 나눌 수 있습니다.

 

인플루엔자 A 및 B 바이러스의 구조

항바이러스제와 인플루엔자에 대한 직접적인 예방접종은 현재 인플루엔자를 치료하고 예방하는 데 중요한 단계입니다. 현재, 닭 배아 기질과 세포 기질은 인플루엔자 백신 연구에서 일반적으로 사용되는 방법이며, 닭 배아는 국내외 연구자들이 인플루엔자 바이러스 액을 준비하기 위해 가장 자주 선택하는 방법입니다. 닭 배아 요막 바이러스액에는 오브알부민 및 바이러스 구조 단백질과 같은 수많은 불순물이 포함되어 있습니다. 오브알부민은 백신을 접종한 개인에게 알레르기 반응을 일으킬 수 있는 중요한 성분입니다.- 따라서 닭 배아 요막 바이러스액의 정화, 농축 및 정제는 인플루엔자 바이러스 백신 개발에 있어 필수적인 단계입니다.

현재 일반적으로 사용되는 바이러스 수확액 정화 기술은 원심분리 + 심층여과 기술입니다. 인플루엔자 바이러스를 정제하는 주요 방법으로는 한외여과, 초원심분리, 겔여과 크로마토그래피, 복합 크로마토그래피 등이 있다.

본 연구는 9~11일령 닭 배아를 대상으로 4종의 인플루엔자 바이러스({0}}H1N1, H3N2, BV, BY{5}})의 감염 특성을 조사하는 것을 목표로 합니다. 후속 하류 바이러스 처리를 위한 기본 물질을 제공하기 위해 닭 배아 배양을 통해 1가 바이러스 요막액을 얻었습니다. 연구 기간 동안 다양한 정화, 농도 및 정제 방법을 비교하여 다른 성분(예: 기타 단백질 및 오브알부민)으로부터 표적 단백질의 분리를 최적화했습니다.

실험적 기술 로드맵

닭 배아를 37도에서 9-11일 동안 배양하였다. 그런 다음 MOI 1:10000의 인플루엔자 A 바이러스(H1N1의 경우 A1, H3N2의 경우 A3)와 MOI 1:10000의 인플루엔자 B 바이러스(BV의 경우 B1, BY의 경우 B2)를 접종했습니다. H1N1과 H3N2 바이러스는 33~34도에서 48시간 배양한 반면, BV와 BY 바이러스는 33도에서 7.2시간 배양했다. 그런 다음 배아를 냉각시키고 요막액을 채취했습니다. 요막액은 총 단백질 함량이 높고 점도가 높으며 탁해 보이므로 명확화가 어렵습니다.

다양한 정화 공정이 IV형 인플루엔자 바이러스 수확액의 품질에 미치는 영향

정화는 정제 공정의 필수 단계로, 다수의 불용성 불순물에 대한 예비 전처리 역할을 합니다. 이 단계에서는 요막액을 원료로 사용합니다. 연속 흐름 고속 원심분리 후 유체는 3μm 및 0.8+0.45μm, 3μm 및 0.8+0.65μm의 기공 크기를 갖는 필터 카트리지를 통해 정화되고 여과됩니다. 두 가지 필터 카트리지 크기가 정화 공정 및 결과에 미치는 영향을 조사하고 최적의 정화 공정을 결정하기 위해 적합한 정화 방식을 선택합니다.

4가지 유형의 인플루엔자 바이러스 청징액 테스트 결과는 그림에 나와 있습니다. 1-3 . CA1-1은 3μm 및 0.8+0.65μm 필터 카트리지를 사용하여 테스트한 청징액의 결과를 나타내고, CA1-2는 3μm 및 0.8+0.45μm 필터 카트리지를 사용하여 테스트한 청징액의 결과를 나타내며 나머지는 유사합니다.

그림 1. 인플루엔자 바이러스 정화액 - 총 단백질 함량 검출 결과

그림 2. 인플루엔자 바이러스 정화액 - 혈구응집 역가 검출 결과

그림 3. 인플루엔자 바이러스 정화액 - 총 단백질 제거율 검출 결과

그 결과, 군간 총 단백질 함량과 총 단백질 제거율에는 수치적 차이가 있었으나 유의미한 차이는 없는 것으로 나타났다. 이는 필터 카트리지의 기공 크기가 너무 작아서 모두 정화 요구 사항을 충족했기 때문일 수 있습니다. 혈액 응고 역가는 3μm 및 0.8+0.45μm 필터 카트리지가 더 높은 혈액 응고 역가를 나타냈습니다. 따라서 최적의 정화를 위해 더 작은 기공 크기의 3μm 및 0.8+0.45μm 필터 카트리지가 선택되었습니다.

참고문헌: Huang, Zhentian. 4가 인플루엔자 바이러스 분리백신의 다운스트림 생산 공정 최적화 [D]. 심양농업대학교, 2024. DOI:10.27327/d.cnki.gshnu.2024.001595.