효율적인 작은 세포외 소포 준비를 위해 초원심분리와 결합된 TFF 접선 흐름 여과

작은 세포외 소포(sEV)는 핵산, 단백질, 작은 분자 및 기타 구성 요소를 포함하는 세포에서 분비되는 나노 크기의 소포이며 세포 간 의사소통에 중요한 역할을 합니다. 엑소솜-형 작은 세포밖 소포체는 모세포와 높은 유사성을 공유합니다. 인공나노입자에 비해 면역제거율과 세포독성이 낮아 유망한 신약 후보생체 내 약물 전달 차량. 거의 모든 유형의 세포가 이러한 소포를 분비할 수 있으며 약물 운반체로서의 응용에 대한 연구가 점차 실험실에서 임상 응용으로 이동하고 있습니다. 하지만,대규모-생산은 여전히 ​​주요 병목 현상으로 남아있습니다.

 

세포외 소포 분리를 위한 현재 방법

현재 세포밖 소포체 분리 방법은 다음과 같습니다.초원심분리, 밀도 구배 원심분리, 크기-배제 크로마토그래피(SEC) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 침전.

PEG 침전은 높은 수율과 간단한 조작을 제공하지만 원치 않는 단백질에 의한 심각한 오염과 관련이 있습니다. 밀도 구배 원심분리 및 크기-배제 크로마토그래피는 고순도-산물을 제공할 수 있지만 효율성이 상대적으로 낮고 프로세스에 시간이 많이 걸립니다-. 초원심분리는 널리 사용되고 있으나 원심분리 용량에 따라 처리량이 제한되어 규모를 확대하기가 어렵다.

 

sEV 분리를 위한 접선 흐름 여과 적용

접선유동여과(TFF)는 이미 리포솜 및 렌티바이러스 벡터와 같은 나노입자의 분리에 적용되었습니다. TFF에서는 공급물이 막 표면을 가로질러 접선 방향으로 흐르므로 막 오염을 줄이고 공정 규모를 더 쉽게 확장할 수 있습니다.

작은 세포밖 소포체는 일반적으로 다음과 같습니다.30~200nm직경, a0.45μm 멤브레인 카세트더 큰 단백질과 소포를 제거하기 위해 TFF 시스템에서 선택할 수 있습니다.300 kDa 멤브레인 카세트저분자량-단백질을 제거하고 배양 배지에 존재하는 작은 세포밖 소포체를 농축하는 데 사용할 수 있습니다.

 

TFF 분리 후 원료의 특성 분석

나노입자 추적 분석(NTA) 결과, 입자 직경은 주로 다음 범위 내에서 분포하는 것으로 나타났습니다.0~250nm.

 

 

그러나 투과전자현미경(TEM)에서는 다량의 오염단백질이 관찰되었으나 세포밖 소포체는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 세포밖 소포체를 추가로 정제하기 위해서는 추가적인 하류 정제 단계가 필요하다는 것을 나타냅니다.

 

100 kDa 한외여과 후 TFF 농축물의 특성 분석

TFF 농축물은 다음을 사용하여 추가로 처리되었습니다.100 kDa 한외여과 튜브.

NTA는 1회 및 2회 한외여과 후 얻은 농축액의 입자 직경이 주로 다음 범위 내에 있음을 보여주었습니다.0~250nm. 그러나 한외여과를 2회 실시한 결과, 얻어지는 입자의 수가 현저히 감소하였다.

TEM 분석 결과, 1회- 또는 2회- 한외여과 농축액에서 소포-유사 구조가 관찰되지 않았으나 상당한 양의 오염 단백질이 남아 있는 것으로 나타났습니다.

그러므로,100 kDa 한외여과는 TFF 농축 후 배양배지 정제에 효과적으로 사용될 수 없었습니다..

 

 

초원심분리에 의해 정제된 TFF 농축액의 특성 분석

NTA는 정제된 제품의 입자 직경이 주로 다음 범위 내에 분포하는 것으로 나타났습니다.0~250nm.

중요한 것은 TEM이 다양한 시야각에 걸쳐 소포와 같은 구조를{0}}분명히 밝혀냈다는 것입니다. 이러한 결과는 TFF를 이용하여 배양액을 농축한 후,초원심분리는 세포밖 소포체의 추가 분리 및 정제를 위해 이후에 사용될 수 있습니다..

 

 

초원심분리와 결합된 TFF를 사용하여 중간엽 줄기 세포 조절 배지에서 분리된 sEV의 특성 분석

NTA는 정제된 제품의 입자 직경이 주로 다음 범위 내에 분포하는 것으로 나타났습니다.0~250nm.

소포{0}}유사 구조가 TEM으로 관찰되었습니다. 웨스턴 블롯 분석에서는 세포외 소포-관련 단백질의 양성 발현이 입증되었습니다.CD9, CD63 및 ALIX정제된 세포밖 소포체에서

이상의 결과를 통해 정제된 작은 세포밖 소포체에 엑소좀이 포함되어 있음을 확인하였으며, 이는 이 방법이 다음과 같은 목적으로도 사용될 수 있음을 나타냅니다.엑소좀 분리 및 추출.

 

 

결론: 고품질 sEV 준비를 위해 초원심분리와 결합된 TFF

연구 결과에 따르면TFF 농도 단독상당한 양의 오염 단백질을 함유한 제품이 생성되었으므로 적격 세포밖 소포체를 얻기에는 불충분했습니다.

마찬가지로,2차 정제용 100 kDa 한외여과 튜브온전한 소포 구조를 효과적으로 생성하지 못했습니다.

TFF 농도와 후속 초원심분리 정제를 결합하면 두 기술의 장점을 통합하여 다음을 얻을 수 있습니다.고품질-소형 세포밖 소포체 제품.

기존의 초원심분리 단독과 비교하여, 결합된 공정은 효과적으로전체 처리 시간을 줄이고 분리 효율성을 향상시킵니다..

이 워크플로에서는TFF를 사용하면 대용량-샘플을 신속하게 강화할 수 있습니다., 대량의 시료를 처리할 때 기존 초원심분리의 한계를 해결합니다. 그런 다음 초원심분리는 심층 정제를 수행하여 공동 농축된 단백질 불순물을 제거하는 동시에 소포의 순도와 무결성을 유지하는 데 도움을 줍니다.

또한, 이 과정에서는 다음을 추가할 필요가 없습니다.외인성 화학 침전 시약, 소포의 생물학적 활동을 최대한 보존하는 데 도움이 됩니다.

산업번역의 관점에서 볼 때, 이 과정은 매우 중요합니다.확장 가능성-세포외 소포체의 대규모 생산과 관련된{0}}문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.약물 전달, 재생 의학 및 관련 제품 개발. 또한 후속 프로세스 최적화 및 파일럿-규모 제조를 위한 견고한 실험 기반을 제공합니다.

 

참조

Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha 등.초원심분리와 접선유동여과를 결합한 작은 세포밖 소포체 분리 방법의 확립 중국 생물학 저널, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.